Stærðfræðilegur grundvöllur upplausnar í litskiljun
Upplausn (Rₛ) lýsir því hversu vel tveir litskiljunartoppar eru aðskildir í tíma eða rúmi. Í grunninn byggir útreikningurinn á Gauss-dreifingu þar sem samhverfir, bjöllulaga toppar eru skilgreindir út frá staðalfráviki (σ). Breidd topps við grunnlínu (w) jafngildir 4σ þar sem snertilínur eru dregnar við beygjupunkta toppsins niður að grunnlínu. Breidd topps í hálfri hæð (w_(1 / 2)) jafngildir hins vegar 2.355σ.
Þegar upplausn er reiknuð út frá toppbreiddum er notast við tvær mismunandi útfærslur eftir því hvar breiddin er mæld:
- Breidd mæld við „Grunnlína (USP 2×)“: Hér er notuð formúlan Rₛ = 2(t_R2 - t_R1) ÷ (w₁ + w₂). Þessi jafna lýsir snertilínubreidd við grunnlínu samkvæmt USP <621>.
- Breidd mæld við „Hálf hæð (USP 1.18×)“: Hér er notuð formúlan Rₛ = 1.18(t_R2 - t_R1) ÷ (w_(1 / 2,1) + w_(1 / 2,2)). Þessi jafna fylgir stöðlum USP <621> og Ph.Eur. 2.2.46.
Þessar jöfnur sýna hvernig fjarlægðin milli toppanna tveggja, eða „Toppabil ΔtR“, deilist með meðalbreidd þeirra. Ef topparnir eru fullkomlega samhverfir gefa báðar aðferðirnar nánast sömu niðurstöðu.
Lyfjaskrárstaðlar og mæliaðferðir
Mismunandi lyfjaskrár og staðalaðferðir (SOP) krefjast þess að tiltekin formúla sé notuð við mat á kerfishæfi. Í evrópsku lyfjaskránni (Ph.Eur. 2.2.46) og þeirri bandarísku (USP <621>) er mæling í hálfri hæð mjög algeng vegna þess að auðveldara er að ákvarða hana á sjálfvirkan hátt í tölvukerfum, sérstaklega þegar suð er í grunnlínu eða þegar toppar skarast lítillega.
Mæling við grunnlínu krefst þess að dregnar séu snertilínur handvirkt eða með reikniriti, sem getur verið viðkvæmt fyrir skekkju ef botnlína litskiljarans er óstöðug. Hins vegar gefur grunnlínuaðferðin skýrari mynd af raunverulegri skörun við botn toppanna þegar unnið er með mjög ólíkar toppstærðir.
Þrjár stýribreytur Purnell-jöfnunnar
Þegar upplausn er reiknuð út frá eiginleikum súlunnar sjálfrar er notast við Purnell-jöfnuna:
Rₛ = (√(N) ÷ 4) · ((α - 1) ÷ α) · (k′₂ ÷ (1 + k′₂))
Þessi jafna sýnir að upplausn stjórnast af þremur óháðum þáttum:
- Skilvirkni (Fræðilegir botnar N): Upplausnin eykst aðeins í hlutfalli við kvaðratrótina af N. Ef tvöfalda á upplausnina með því einu að lengja súluna eða minnka kornastærð þarf fjórfaldan botnafjölda.
- Sértækni (α): Þetta er hlutfall rýmdarstuðlanna, α = k′₂ ÷ k′₁. Sértæknin lýsir efnafræðilegum mun á samskiptum efnanna við kyrrstæða og hreyfanlega fasann. Lítil breyting á sértækni hefur gríðarleg áhrif á upplausnina og er hún öflugasta tækið við þróun nýrra aðferða.
- Rýmdarstuðull (k′): Lýsir því hversu lengi efnin dvelja í kyrrstæða fasanum miðað við dauttímann (t_M). Rýmdarstuðullinn er reiknaður sem k′ = (t_R - t_M) ÷ t_M. Ef k′ er of lágt (undir 2) elúera efnin of snemma og skiljast illa. Ef k′ er mjög hátt (yfir 10) lengist greiningartíminn án þess að það bæti upplausnina verulega.
Eðlisfræði grunnlínuskila og takmarkanir
Gildið Rₛ = 1.5 er almennt skilgreint sem lágmarkskrafa fyrir „grunnlínuskil“. Við þetta gildi skarast tveir jafnstórir Gauss-toppar um það bil 0.1%, sem þýðir að hægt er að magnmæla bæði efnin með mikilli nákvæmni.
| Upplausn (Rₛ) | Skörun (jafnstórir toppar) | Flokkun og túlkun |
|---|---|---|
| < 1.0 | > 2% | „léleg skil — topparnir skarast enn“ |
| 1.0 – 1.49 | ~ 2% til 0.2% | „að hluta til skilin“ |
| ≥ 1.5 | ≤ 0.1% | „grunnlínuskilin“ |
Báðar breiddarformúlurnar gefa villandi niðurstöður ef topparnir eru ósamhverfir. Ef um er að ræða skottun (tailing) eða framhlaup (fronting) munu raunveruleg skil vera lélegri en reiknað Rₛ-gildi gefur til kynna. Einnig er erfitt að mæla breiddir örugglega ef upplausnin er mjög lág, og þá þarf að styðjast við samþættingarhugbúnað litskiljans. Ef topparnir eru mjög ólíkir að stærð, til dæmis ef lítið óhreinindi elúerar rétt á eftir stórum aðaltoppi, dugar Rₛ = 1.5 ekki og krafist er hærri upplausnar til að tryggja nákvæma greiningu.
Notkun í þynnulags litskiljun (TLC)
Þótt upplausnarformúlur séu oftast notaðar í vökvagskiljun (HPLC) eða gasskiljun (GC), er hægt að yfirfæra þær beint á þynnulags litskiljun (TLC). Í stað gæslutíma í mínútum eða sekúndum eru notaðar flæðivegalengdir bletta frá ráslínu í millimetrum. Breidd blettanna er mæld sem þvermál þeirra í sömu einingu. Þar sem upplausn er hlutfall tveggja gilda með sömu einingu styttast millimetrarnir út og reiknað Rₛ-gildi verður nákvæmlega það sama.
Útreikningar og villuboð í kerfinu
Reiknivélin framkvæmir alla útreikninga staðbundið í vafra notandans. Engin gögn eða tölur sem slegnar eru inn eru sendar á ytri netþjóna.
Kerfið fylgir ströngum reglum við útreikninga og sýnir villuboð ef slegin gildi standast ekki kröfur:
- Ef slegið er inn gildi sem er ekki tala:
"‹field›: „‹token›“ er ekki tala." - Ef gæslutími eða breidd er núll eða neikvæð tala:
"‹field› verður að vera stærra en núll." - Ef fyrri toppurinn er skráður með jafnan eða lengri gæslutíma en sá seinni:
"Seinni toppurinn verður að koma fram á eftir þeim fyrri — víxlaðu gæslutímunum ef þeim hefur verið snúið við." - Ef dauttími er núll eða neikvæður:
"Dauttíminn verður að vera stærri en núll." - Ef fyrsti toppurinn kemur fram á undan dauttíma:
"Fyrsti toppurinn verður að koma fram eftir dauttímann, annars er rýmdarstuðull hans ekki jákvæður." - Ef fjöldi fræðilegra botna er núll eða neikvæður:
"Fjöldi fræðilegra botna verður að vera stærri en núll." - Ef reiknuð sértækni er 1 eða minni:
"Gæslutímarnir gefa sértækni sem er 1 eða minni, svo enginn botnafjöldi getur skilið þessi efni að — breyta þarf hreyfanlega eða kyrrstæða fasanum fyrst." - Ef tölur fara yfir mörk kerfisins:
"Gildi eða milliniðurstaða fer yfir leyfilegt talnasvið."
Algengar spurningar
Hvaða upplausn telst vera „grunnlínuskil“? Rs = 1.5 fyrir tvo jafnstóra, samhverfa toppa: miðjur þeirra liggja í sex staðalfrávika fjarlægð hvor frá annarri og skörunin er um 0.1%. Við Rs = 1.0 skarast enn um 2%, sem dugar oft til greiningar en ekki til nákvæmrar magnmælingar. Margar lyfjaskrár krefjast 1.5 eða 2.0 til að tryggja áreiðanleika aðferðarinnar, og lítill toppur sem liggur þétt upp við stóran nágranna þarf meira en 1.5.
Breidd við grunnlínu eða í hálfri hæð — hvora ætti ég að nota? Notaðu þá formúlu sem tilgreind er í þinni lyfjaskrá, staðalaðferð (SOP) eða gagnakerfi, og haltu þig við hana til samanburðar. Snertilínubreidd (grunnlína) er klassíska lyfjaskrárformúlan; auðveldara er að mæla breidd í hálfri hæð á suðsömum eða hálfsamrunnum toppum og það er hún sem flestur litskiljunhugbúnaður sýnir. Fyrir samhverfan topp ber þessum tveimur saman upp á brot úr prósenti, þar sem Gauss-toppur er 4σ breiður við grunnlínu og 2.355σ í hálfri hæð.
Upplausnin mín er of lág — hvað bætir hana? Upplausnarformúlan hefur þrjár stýribreytur. Skilvirkni N (lengri súla eða minni agnir) hjálpar aðeins með kvaðratrót sinni, þannig að tvöföldun á N eykur Rs um u.þ.b. 41%. Sértækni α (breytt efnasamsetning súlu eða hreyfanlegs fasa) er öflugasta stýribreytan. Rýmd k′ skiptir mestu máli á lága sviðinu — skil virka best þegar k′ er á milli u.þ.b. 2 og 10. Súlubreytustillingin sýnir nákvæmlega hversu marga botna þín gildi fyrir α og k′ þurfa til að ná Rs = 1.5.
Get ég notað þetta fyrir TLC-plötu? Já. Sama formúla fyrir hálfa hæð gildir um flæðivegalengdir á plötu: sláðu inn vegalengdirnar sem tveir blettir ferðuðust sem gæslugildi og þvermál þeirra sem breiddir, allt í millimetrum. Rs er hlutfall, þannig að einingin styttist út — það eina sem skiptir máli er að nota sömu eininguna í öll gildi.