Chromatografinės skyros skaičiuoklė

Chromatografinės skyros matematiniai pagrindai

Chromatografinė skyra (Rs) yra dimensijos neturintis dydis, apibūdinantis dviejų gretimų chromatografinių smailių atskyrimo kokybę. Šis rodiklis tiesiogiai parodo, kiek smailės yra nutolusios viena nuo kitos, palyginti su jų pačių pločiu. Matematiškai skyra yra grindžiama Gauso smailės teorija, kurioje smailės plotis yra susijęs su standartiniu nuokrypiu (σ).

Klasikinėje chromatografijoje smailės plotis ties bazine linija apibrėžiamas kaip 4σ, o plotis pusės aukščio lygyje – kaip 2.355σ. Kai smailės plotis matuojamas ties bazine linija, naudojama formulė: Rs = 2(tR2 − tR1) ÷ (w₁ + w₂) — USP <621>, tangentiniai pločiai ties bazine linija.

Jei smailės plotis matuojamas pusės aukščio lygyje, formulė perskaičiuojama atsižvelgiant į kitą standartinio nuokrypio santykį: Rs = 1.18(tR2 − tR1) ÷ (w½,₁ + w½,₂) — USP <621> / Ph.Eur. 2.2.46, pločiai pusės aukščio lygyje.

Šios formulės daro prielaidą, kad smailės yra simetriškos ir varpo formos. Jei smailės pasižymi asimetrija – pavyzdžiui, stebimas smailės uodega (tailing) arba priekis (fronting) – skaičiuoklės pateikiama Rs vertė gali pervertinti realią atskyrimo kokybę. Esant labai mažai skyrai, tiksliai išmatuoti smailių pločius tampa sudėtinga, todėl ribinius atvejus rekomenduojama tikrinti naudojant integravimo programinę įrangą.

Farmakopėjos standartai ir smailių pločių matavimas

Analitinėje chemijoje taikomi skirtingi standartai, priklausomai nuo regioninių ar metodinių reikalavimų. Jungtinių Valstijų farmakopėja (USP <621>) leidžia naudoti abu matavimo metodus – tiek tangentinius pločius ties bazine linija, tiek pločius pusės aukščio lygyje. Europos farmakopėja (Ph.Eur. 2.2.46) pirmenybę teikia pločiui pusės aukščio lygyje.

• Bazinė linija (USP 2×): Šis metodas reikalauja nubrėžti tangentines linijas išilgai smailės šonų iki susikirtimo su bazine linija. Jis yra jautresnis smailės asimetrijai ir triukšmui ties bazine linija.
• Pusė aukščio (USP 1.18×): Šis matavimas atliekamas tiesiai ties 50% smailės aukščio. Tai yra praktiškesnis pasirinkimas, kai smailės iš dalies persidengia arba kai bazinė linija yra triukšminga, nes matavimo taškas yra toliau nuo triukšmo zonos.

Skaičiuoklėje pasirinkus atitinkamą režimą, vartotojui pateikiama konkreti formulė ir reikšmių įstatymas, leidžiantis sekti skaičiavimo eigą.

Trys Purnell lygties svertas

Kai skyros skaičiavimui naudojami ne smailių pločiai, o kolonėlės efektyvumo ir sulaikymo parametrai, taikoma Purnell lygtis: Rs = (√N ÷ 4) · ((α − 1) ÷ α) · (k′₂ ÷ (1 + k′₂)) — skyros lygtis.

Ši lygtis atskleidžia tris nepriklausomus veiksnius, kuriais galima manipuliuoti optimizuojant chromatografinį atskyrimą:

1. Efektyvumas (Teorinės lėkštelės N): Skyra didėja proporcingai teorinių lėkštelių skaičiaus kvadratinei šakniai (√N). Norint padvigubinti skyrą, lėkštelių skaičių reikia padidinti keturis kartus.
2. Selektyvumas (α): Tai yra stipriausias svertas skyrai padidinti. Selektyvumas apibūdina cheminių fazių gebėjimą skirti du junginius ir yra apskaičiuojamas kaip sulaikymo faktorių santykis: α = k′₂ ÷ k′₁.
3. Sulaikymas (Sulaikymo faktorius k′): Sulaikymo faktorius parodo, kiek laiko medžiaga praleidžia stacionarioje fazėje, palyginti su mobiliąja faze. Didžiausią įtaką skyrai k′ turi tada, kai jo vertės yra mažos (iki 2). Kai k′ viršija 10, tolesnis sulaikymo didinimas skyros beveik nebepagerina, o tik pailgina analizės laiką.

Skaičiuoklės įvesties parametrai ir valdymas

Skaičiuoklė leidžia pasirinkti vieną iš dviejų pradinių duomenų režimų:

• Smailių pločiai: Reikalauja įvesti Pirmosios smailės sulaikymo laikas tR1, Antrosios smailės sulaikymo laikas tR2, Pirmosios smailės plotis w₁ ir Antrosios smailės plotis w₂. Taip pat pasirenkamas pločio matavimo lygis.
• Kolonėlės parametrai: Reikalauja įvesti Mirusysis laikas tM, Pirmosios smailės sulaikymo laikas tR1, Antrosios smailės sulaikymo laikas tR2 ir Teorinės lėkštelės N.

Vartotojas gali pasirinkti įvestų verčių vienetą (minutes arba sekundes). Kadangi skyra yra santykis, vienetai galutiniame rezultate suprastėja, todėl įvestos vertės gali būti pateikiamos bet kokiais suderintais vienetais, įskaitant milimetrus plonasluoksnėje chromatografijoje. Skaičiuoklėje taip pat galima nustatyti rodomų skaitmenų po kablelio skaičių, naudoti mygtuką „Įkelti pavyzdį“ greitam susipažinimui arba „Išvalyti“ visiškam laukų nuliui nustatymui.

Rezultatai ir klaidų apdorojimas

Atlikus skaičiavimą, skaičiuoklė pateikia šiuos rezultatus:

• Skyra Rs: Tiksli skaitinė vertė su kokybine atskyrimo išvada.
• Atskyrimo išvada: Priklausomai nuo gautos Rs vertės, pateikiamas vienas iš trijų vertinimų: „prastai atskirta – smailės vis dar persidengia“, „iš dalies atskirta“ arba „atskirta iki bazinės linijos“.
• Vizualinė skalė: Skalė nuo 0 iki 2, rodanti, kur patenka apskaičiuota skyra; 1.0 žymi dalinį atskyrimą, o 1.5 žymi atskyrimą iki bazinės linijos.
• Tarpiniai skaičiavimai: Rodomas atstumas tarp smailių ΔtR, abiejų pločių suma (pločių režime), sulaikymo faktoriai k′₁ ir k′₂, selektyvumas α bei lėkštelių skaičius, reikalingas Rs = 1.5 (kolonėlės parametrų režime).

Skaičiuoklėje įdiegtos griežtos validacijos taisyklės, apsaugančios nuo neteisingų įvesčių. Pavyzdžiui, jei įvedamas ne skaičius, rodoma klaida: „‹field›: „‹token›“ nėra skaičius.“. Jei sulaikymo laikas arba plotis yra neigiamas, sistema praneša: „‹field› turi būti didesnis už nulį.“. Jei pirmoji smailė eliuuojasi greičiau už mirusįjį laiką, pateikiama klaida: „Pirmoji smailė turi eliuuotis po mirusiojo laiko, kitaip jos sulaikymo faktorius nėra teigiamas.“. Jei sulaikymo laikai rodo, kad selektyvumas yra 1 arba mažesnis, vartotojas įspėjamas: „Sulaikymo laikai rodo, kad selektyvumas yra 1 arba mažesnis, todėl joks lėkštelių skaičius negali atskirti šios poros – pirmiausia reikia pakeisti mobiliąją arba stacionariąją fazę.“.

Duomenų apdorojimas ir privatumas

Visi skaičiavimai atliekami lokaliai, tiesiogiai vartotojo interneto naršyklėje. Kiekvienas jūsų įvestas skaičius lieka šioje naršyklėje – niekas nėra įkeliama.

Dažniausiai užduodami klausimai (FAQ)

Kokia skyra laikoma „bazine linija atskirtomis smailėmis“? Rs = 1.5 taikoma dviem vienodo dydžio simetriškoms smailėms: jų centrai nutolę per šešis standartinius nuokrypius, o persidengimas siekia apie 0.1%. Kai Rs = 1.0, vis dar persidengia maždaug 2%, kas dažnai tinka identifikavimui, bet ne tiksliam kiekybiniam įvertinimui. Daugelis farmakopėjos monografijų reikalauja 1.5 arba 2.0, kad metodas išliktų patikimas, o mažai smailei, esančiai šalia didelės kaimynės, reikia daugiau nei 1.5.

Bazinės linijos plotis ar plotis pusės aukščio lygyje – kurį turėčiau naudoti? Naudokite tą, kuri nurodyta jūsų monografijoje, standartinėje darbo procedūroje (SOP) ar duomenų sistemoje, ir laikykitės jos palyginimams. Tangentinis (bazinės linijos) plotis yra klasikinė farmakopėjos forma; plotį pusės aukščio lygyje lengviau išmatuoti triukšmingose arba iš dalies susiliejusiose smailėse, ir būtent jį pateikia dauguma chromatografijos programinių įrangų. Simetriškos smailės atveju abu variantai sutampa procento dalies tikslumu, nes Gauso smailės plotis ties bazine linija yra 4σ, o pusės aukščio lygyje – 2.355σ.

Mano skyra per maža – kas ją pagerina? Skyros lygtis turi tris svertus. Efektyvumas N (ilgesnė kolonėlė arba mažesnės dalelės) padeda tik proporcingai savo kvadratinei šakniai, todėl padvigubinus N, Rs padidėja apie 41%. Selektyvumas α (kita kolonėlės chemija arba mobiliosios fazės sudėtis) yra stipriausias svertas. Sulaikymas k′ labiausiai svarbus žemame diapazone – atskyrimas geriausiai veikia, kai k′ yra tarp maždaug 2 ir 10. Kolonėlės parametrų režimas tiksliai parodo, kiek lėkštelių reikėtų jūsų α ir k′, kad Rs būtų 1.5.

Ar galiu tai naudoti plonasluoksnės chromatografijos (TLC) plokštelei? Taip. Ta punkto pusės aukščio formulė taikoma ir migracijos atstumams plokštelėje: įveskite atstumus, kuriuos nukeliavo dvi dėmės, kaip sulaikymo vertes, o jų skersmenis – kaip pločius, viską milimetrais. Rs yra santykis, todėl vienetai suprastėja – svarbiausia yra nuoseklumas.