La resolució cromatogràfica (Rₛ) és el paràmetre fonamental per avaluar la capacitat d'un sistema químic de separar dos components que elueixen de manera consecutiva. Aquesta eina en línia permet determinar la resolució mitjançant dos mètodes de càlcul diferents segons les dades de partida disponibles: a partir de les amplades de pic i els temps de retenció, o bé mitjançant els paràmetres físics de la columna.
Tots els càlculs es realitzen localment dins del navegador web de l'usuari. Les dades introduïdes no es pengen a cap servidor extern, de manera que el processament es manté íntegrament en l'àmbit local.
Els fonaments matemàtics de la resolució
La resolució descriu el grau de separació física entre dues bandes cromatogràfiques. Des del punt de vista de la teoria gaussiana, un pic simètric es distribueix segons una desviació estàndard (σ). L'amplada d'un pic a la línia de base obtinguda mitjançant les tangents correspon a 4σ, mentre que l'amplada a mitja alçada equival a 2.355σ.
Quan s'utilitzen les dimensions dels pics, la calculadora aplica les equacions normalitzades per les principals farmacopees. Si es selecciona el mode d'amplades de pic, l'usuari pot triar entre dues metodologies de mesura:
- Línia de base (USP 2×): Utilitza l'equació Rₛ = 2(t_R2 - t_R1) ÷ (w₁ + w₂). Aquesta fórmula es basa en les amplades tangents mesurades a la línia de base de la senyal.
- Mitja alçada (USP 1.18×): Aplica la fórmula Rₛ = 1.18(t_R2 - t_R1) ÷ (w_(1 / 2,1) + w_(1 / 2,2)). És el mètode de referència harmonitzat per la Farmacopea dels Estats Units (USP <621>) i la Farmacopea Europea (Ph.Eur. 2.2.46).
Les tres palanques de l'equació de Purnell
Quan no es disposa de les amplades dels pics però es coneixen les propietats de la columna, la resolució es calcula mitjançant l'equació de Purnell. Aquesta relació matemàtica desglossa la resolució en tres factors independents que actuen com a palanques d'optimització:
Rₛ = (√(N)) / 4 · (α - 1) / (α) · k′₂ / (1 + k′₂)
Aquest enfocament descriu com es construeix la separació a partir de variables termodinàmiques i cinètiques:
- Eficiència (N): Representada pel nombre de plats teòrics. La resolució millora de manera proporcional a l'arrel quadrada de l'eficiència (√(N)). Per tant, duplicar la longitud de la columna només incrementa la resolució en un factor d'aproximadament 1.41.
- Selectivitat (α): És la relació entre els factors de retenció dels dos pics (α = k′₂ ÷ k′₁). És el paràmetre més potent per optimitzar una separació, ja que depèn directament de la naturalesa química de la fase estacionària i de la fase mòbil.
- Retenció (k′): El factor de retenció del segon pic (k′₂) descriu el temps que passa la substància interaccionant amb la fase estacionària en relació amb el temps mort (t_M). El seu efecte sobre la resolució és significatiu per a valors baixos de k′, però s'estabilitza ràpidament quan k′ se situa entre 2 i 10.
Funcionament de la calculadora i dades d'entrada
L'usuari ha de seleccionar primer el tipus de dades de partida a l'opció Dades de partida:
Mode «Amplades de pic»
Requereix els següents paràmetres numèrics positius:
- Temps de retenció del primer pic tR1 (Temps de retenció del primer pic tR1 / Temps de retenció del primer pic).
- Temps de retenció del segon pic tR2 (Temps de retenció del segon pic tR2 / Temps de retenció del segon pic).
- Amplada del primer pic w₁ (Amplada del primer pic w₁ / Amplada del primer pic).
- Amplada del segon pic w₂ (Amplada del segon pic w₂ / Amplada del segon pic).
- Amplada mesurada a: Permet escollir entre Línia de base (USP 2×) o Mitja alçada (USP 1.18×).
Mode «Paràmetres de la columna»
Requereix la introducció de les següents variables:
- Temps de retenció del primer pic tR1 (Temps de retenció del primer pic tR1 / Temps de retenció del primer pic).
- Temps de retenció del segon pic tR2 (Temps de retenció del segon pic tR2 / Temps de retenció del segon pic).
- Temps mort tM (Temps mort tM / Temps mort).
- Plats teòrics N (Plats teòrics N / Plats teòrics).
Configuració addicional
- Unitat dels valors introduïts: Permet definir l'etiqueta de la unitat de temps (minuts o segons). Atès que la resolució és una relació adimensional, les unitats se simplifiquen matemàticament. L'únic requisit és que totes les dades temporals comparteixin la mateixa unitat.
- Decimals mostrats: Controla la precisió numèrica dels resultats a la pantalla.
L'interfície disposa del botó Carrega un exemple per omplir automàticament els camps amb valors de prova, i del botó Neteja per restablir el formulari.
Resultats i interpretació del veredicte
Un cop introduïdes les dades vàlides, l'eina mostra els resultats a la secció Resolució:
- Resolució Rs: El valor numèric final calculat.
- Veredicte de separació: Una avaluació qualitativa basada en el valor de Rₛ:
- "mal separats: els pics encara se solapen" (per a valors inferiors a 1.0).
- "parcialment separats" (per a valors entre 1.0 i 1.5).
- "separats a la línia de base" (per a valors de 1.5 o superiors).
- Escala visual: Una representació gràfica de 0 a 2 on es marca la posició de la resolució obtinguda, destacant els llindars crítics de 1.0 i 1.5.
- Espaiat de pics ΔtR: La diferència entre els dos temps de retenció.
- Suma de les dues amplades: El valor agregat de les amplades introduïdes (mode d'amplades de pic).
- Factor de retenció k′₁ i Factor de retenció k′₂: Els factors de retenció calculats per a cada pic (mode de paràmetres de columna).
- Selectivitat α: La raó de selectivitat entre els dos pics (mode de paràmetres de columna).
- Plats necessaris per a Rs = 1.5: El nombre de plats teòrics requerits per assolir la separació de línia de base (mode de paràmetres de columna).
A la secció Fórmula i substitució, es detalla el procediment matemàtic pas a pas amb els valors de l'usuari inserits en les equacions de derivació corresponents. També es calcula el nombre de Plats necessaris per a Rs = 1.5 en el mode de paràmetres de columna. El botó Copia el resultat permet desar tota aquesta informació al porta-retalls.
Regles de validació i límits del model
Per garantir la coherència física dels càlculs, l'eina aplica les següents regles de validació i mostra missatges d'error específics si no es compleixen:
- Si s'introdueix un caràcter no numèric:
"‹field›: «‹token›» no és un número.". - Si un temps de retenció o una amplada és igual o inferior a zero:
"‹field› ha de ser superior a zero."o"‹field› ha de ser superior a zero.". - Si el primer pic elueix abans o al mateix temps que el segon:
"El segon pic ha d'eluir després del primer; intercanvieu els temps de retenció si estan invertits.". - Si el temps mort és igual o inferior a zero:
"El temps mort ha de ser superior a zero.". - Si el primer pic elueix abans del temps mort de la columna:
"El primer pic ha d'eluir després del temps mort, o el seu factor de retenció no és positiu.". - Si el nombre de plats és igual o inferior a zero:
"El nombre de plats ha de ser superior a zero.". - Si la selectivitat calculada és igual o inferior a 1:
"Els temps de retenció situen la selectivitat en 1 o menys, de manera que cap nombre de plats pot separar aquesta parella; primer cal canviar la fase mòbil o estacionària.". - Si es produeix un desbordament numèric en els càlculs:
"Un valor o resultat intermedi supera el rang de nombres admès.".
Cal tenir en compte que les fórmules d'amplada assumeixen pics simètrics i acampanats de mides similars. Si els pics presenten cua (tailing) o front (fronting), la resolució real serà inferior a la calculada teòricament. En aquests casos, o quan la resolució és extremadament baixa, es recomana verificar la integració mitjançant el programari del cromatògraf.
Preguntes freqüents (FAQ)
Quina resolució es considera «separació de línia de base»? Rs = 1.5 per a dos pics simètrics i de la mateixa mida: els seus centres se situen a sis desviacions estàndard de distància i el solapament és d'aproximadament el 0.1%. Amb una Rs = 1.0, encara se solapa vora el 2%, la qual cosa sol ser acceptable per a la identificació però no per a una quantificació precisa. Moltes monografies de farmacopea demanen 1.5 o 2.0 per mantenir la robustesa del mètode, i un pic petit que es troba al costat d'un veí gran necessita més d'1.5.
Amplada a la línia de base o amplada a mitja alçada: quina he d'utilitzar? Utilitzeu la que s'indiqui a la vostra monografia, PNT o sistema de dades, i mantingueu-la per fer comparacions. L'amplada a la línia de base (tangent) és la forma clàssica de la farmacopea; l'amplada a mitja alçada és més fàcil de mesurar en pics amb soroll o parcialment fusionats, i és la que reporten la majoria de programaris de cromatografia. Per a un pic simètric, totes dues coincideixen amb una diferència d'una fracció de percentatge, ja que un pic gaussià té una amplada de 4σ a la línia de base i de 2.355σ a mitja alçada.
La meva resolució és massa baixa: què la pot millorar? L'equació de resolució té tres palanques. L'eficiència N (una columna més llarga o partícules més petites) només ajuda amb la seva arrel quadrada, de manera que duplicar N augmenta la Rs aproximadament un 41%. La selectivitat α (una química de columna o composició de fase mòbil diferent) és la palanca més potent. La retenció k′ és més important en el rang baix: les separacions funcionen millor amb una k′ d'entre 2 i 10 aproximadament. El mode de paràmetres de columna mostra exactament quants plats necessitarien la vostra α i k′ per a una Rs = 1.5.
Puc utilitzar-ho per a una placa de TLC? Sí. La mateixa fórmula de mitja alçada s'aplica a les distàncies de migració en una placa: introduïu les distàncies que han recorregut les dues taques com a valors de retenció i els seus diàmetres com a amplades, tot en mil·límetres. La Rs és una relació, de manera que la unitat se simplifica; l'únic que importa és la coherència.